实时荧光定量PCR是什么

FanlyQA2020-09-27 02:10:47阅读(...)

实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。·

实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在 DNA 扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定 DNA 序列进行定量分析的方法。·

实时荧光定量PCR是什么

Real-timePCR 是在 PCR 扩增过程中,通过荧光信号,对 PCR 进程进行实时检测。由于在 PCR 扩增的指数时期,模板的 Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。

原理

所谓实时荧光定量 PCR 技术,是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

检测方法

1.SYBRGreenⅠ法:

在 PCR 反应体系中,加入过量 SYBR 荧光染料,SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。

SYBR 定量 PCR 扩增荧光曲线图

PCR 产物熔解曲线图(单一峰图表明 PCR 扩增产物的单一性)

2.TaqMan 探针法:

探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR 扩增时,Taq 酶的 5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条 DNA 链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与 PCR 产物的形成完全同步。

服务流程

1.客户认真写好订单,提供待检基因相关信息;

2.签订技术服务合同,支付预付款(30-50%);

3.设计合成定量 PCR 引物(或客户提供文献引物委托本公司合成);

4.DNA/RNA 的抽提、定量、RNA 反转录;

5.PCR 预实验,主要检测引物的特异性和扩增效率;

6.正式定量实验:对所有样品上机检测;

7.实验结果和数据分析,形成报告。

收费标准

优惠包干价:120 元/样/基因(SYBRgreenI 法,相对定量)

(含 RNA 提取,反转录,引物合成费用,上机测试费用(3 个重复);一个内参免费(内参 3 个重复)

技术原理

将标记有荧光素的 Taqman 探针与模板 DNA 混合后,完成高温变性,低温复性,适温延伸的热循环,并遵守聚合酶链反应规律,与模板 DNA 互补配对的 Taqman 探针被切断,荧光素游离于反应体系中,在特定光激发下发出荧光,随着循环次数的增加,被扩增的目的基因片段呈指数规律增长,通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度,求得 Ct 值,同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照,即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

Ct 值

Ct 值(Cycle threshold,循环阈值)的含义为:每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数

图 1

(如图 1 所示)。

1. 荧光阈值(threshold)的设定

PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光阈值的缺省(默认)设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍,即:threshold = 10*SDcycle 3-15

2. Ct 值与起始模板的关系

每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,公式如下。

Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)

n 为扩增反应的循环次数,X0 为初始模板量,Ex 为扩增效率,N 为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。

起始拷贝数越多,Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代 Ct 值。因此,只要获得未知样品的 Ct 值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

荧光化学物质

实时荧光定量 PCR 所使用的荧光物质可分为两种:荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下:

1. TaqMan 荧光探针:PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR 扩增时,Taq 酶的 5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条 DNA 链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。而新型 TaqMan-MGB 探针使该技术既可进行基因定量分析,又可分析基因突变(SNP),有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。

2. SYBR 荧光染料:在 PCR 反应体系中,加入过量 SYBR 荧光染料,SYBR 荧光染料非特异性地掺入 DNA 双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。SYBR 仅与双链 DNA 进行结合,因此可以通过溶解曲线,确定 PCR 反应是否特异。

3. 分子信标:是一种在 5 和 3 末端自身形成一个 8 个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针,两端的核酸序列互补配对,导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近,不会产生荧光。PCR 产物生成后,退火过程中,分子信标中间部分与特定 DNA 序列配对,荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。

传统定量 PCR

1.传统定量 PCR方法简介

1)内参照法:在不同的 PCR 反应管中加入已定量的内标和引物,内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记,下游引物不标记。在模板扩增的同时,内标也被扩增。在 PCR 产物中,由于内标与靶模板的长度不同,二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来,分别测定其荧光强度,以内标为对照定量待检测模板。

2)竞争法:选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中,待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增(其中一个引物为荧光标记)。扩增后用内切酶消化 PCR 产物,竞争性模板的产物被酶解为两个片段,而待测模板不被酶切,可通过电泳或高效液相将两种产物分开,分别测定荧光强度,根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。

3)PCR-ELISA 法:利用地高辛或生物素等标记引物,扩增产物被固相板上特异的探针所结合,再加入抗地高辛或生物素酶标抗体-辣根过氧化物酶结合物,最终酶使底物显色。常规的 PCR-ELISA 法只是定性实验,若加入内标,作出标准曲线,也可实现定量检测目的。

2.内标在传统定量中的作用

由于传统定量方法都是终点检测,即 PCR 到达平台期后进行检测,而 PCR 经过对数期扩增到达平台期时,检测重现性极差。同一个模板在 96 孔 PCR 仪上做 96 次重复实验,所得结果有很大差异,因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后,可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此,传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

3.内标对定量 PCR 的影响

若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标,则 PCR 反应变为双重 PCR,双重 PCR 反应中存在两种模板之间的干扰和竞争,尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时,这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的,所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因,传统定量方法虽然加入内标,但仍然只是一种半定量的方法。

实时荧光定量 PCR

实时荧光定量 PCR 技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品 Ct 值的计算,根据标准曲线获得定量结果。因此,实时荧光定量 PCR 无需内标是建立在两个基础之上的:

1)Ct 值的重现性 PCR 循环在到达 Ct 值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,因此 Ct 值的重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的 Ct 值是恒定的。

2)Ct 值与起始模板的线性关系由于 Ct 值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定,因此,实时荧光定量 PCR 是一种采用外标准曲线定量的方法。

外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量 PCR 是迄今为止定量最准确,重现性最好的定量方法,已得到全世界的公认,广泛用于基因表达研究、转基因研究,药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

实时荧光定量 PCR 的定量方法

在 Real-timePCR 中,模板定量有两种策略,相对定量和绝对定量。

相关应用

临床疾病诊断

各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价;地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测;肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断;遗传基因检测实现遗传病诊断。

动物疾病检测

禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭疽芽孢杆菌。

食品安全

食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。

科学研究

医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。

应用行业

各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。

由于 qPCR 是实时定量检测致病病原体基因核酸,因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优势。

关于名称

根据 MIQE(Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments)的指导方针,qPCR 为 Quantitative real-time PCR 的简称,RT-qPCR 指的是 Reverse transcription–qPCR,RT-PCR 仅用来表示 Reverse transcription polymerase chain reaction,而不是 Real-time PCR,但是有少数作者并没有坚持这一原则。

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